实验目的

大量研究表明多肽能够直接与免疫细胞表面受体作用，从而激活相关的免疫调节信号通路，促进免疫因子的表达，从而调节机体的免疫力。

本研究聚焦于鲟鱼多肽，采用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞模型，初步评价鲟鱼多肽的免疫调节活性。

实验方案

RAW264.7是一种单核巨噬细胞，其包括组织中包括组织中的巨噬细胞、骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞，它们能够清除多种病原物质，在机体防御中起着重要作用。不仅能够启动先天性免疫（非特异性免疫）应答，而且还能参与细胞免疫（特异性免疫）应答，在机体抵抗微生物感染、肿瘤等许多疾病过程中均发挥重要的作用。因此，RAW264.7常作为理想的细胞模型来评价生物活性物质的免疫调节活性。

以鲟鱼多肽为原料，通过MTT细胞毒性实验测定样品对RAW264.7细胞毒性并筛选出合适的实验剂量进行下一步实验、通过Griess试剂法测定NO释放量初步评价该鲟鱼多肽的免疫调节活性。

实验方法

3.1 MTT实验测定鲟鱼多肽对细胞存活率的影响

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)能够被活细胞体内的线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的结晶沉淀物，不能被死细胞还原，二甲亚砜能够溶解紫色沉淀物，其溶液在490nm处的吸光度值能反应活细胞的数量。

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度，按1×10^5个/ml每孔100ul细胞接种于96孔板中，于37℃ 5% CO2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100ul DMEM基础培养基（不含血清）；阳性对照组加入100 ul LPS（基础培养基稀释至1ug/ml）；实验组给予不同浓度（12.5-1000ug/ml）的鲟鱼多肽溶液（基础培养基配制），继续培养24 h，弃掉上清，加入100ul的MTT溶液（用DMEM基础培养基配制成终浓度0.5 mg/ml），然后进一步温育4小时。吸出培养基后，向各孔中加入150ul DMSO以溶解甲瓒晶体，在490nm处测定其吸光度值。细胞活力=（OD实验-OD空白）/（ODcontrol-OD空白）。

3.2 鲟鱼多肽对细胞分泌NO的影响

取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10^6个/ml接种于24孔板中，于37℃ 5% CO2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100ul DMEM基础培养基（不含血清）；实验组给予不同浓度（12.5-500ug/ml）的鲟鱼多肽（基础培养基配制），继续培养24 h，收集上清液2500r/min离心10min，分别取100ul于酶标板中，然后加入等量的Griess试剂，室温静置30min后，于540nm处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中的亚硝酸盐（NO