实验发现，鲟鱼肽可促进Raw264.7细胞的增殖，在250µg/ml增殖活性最大为143.97±8.6%。鲟鱼肽能够促进Raw264.7分泌NO，具有一定的免疫调节作用。
实验目的
大量研究表明多肽能够直接与免疫细胞表面受体作用，从而激活相关的免疫调节信号通路，促进免疫因子的表达，从而调节机体的免疫力。
本研究聚焦于鲟鱼多肽，采用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作为细胞模型，初步评价鲟鱼多肽的免疫调节活性。
实验方案
RAW264.7是一种单核巨噬细胞，其包括组织中包括组织中的巨噬细胞、骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞，它们能够清除多种病原物质，在机体防御中起着重要作用。不仅能够启动先天性免疫（非特异性免疫）应答，而且还能参与细胞免疫（特异性免疫）应答，在机体抵抗微生物感染、肿瘤等许多疾病过程中均发挥重要的作用。因此，RAW264.7常作为理想的细胞模型来评价生物活性物质的免疫调节活性。
以鲟鱼多肽为原料，通过MTT细胞毒性实验测定样品对RAW264.7细胞毒性并筛选出合适的实验剂量进行下一步实验、通过Griess试剂法测定NO释放量初步评价该鲟鱼多肽的免疫调节活性。
实验方法
3.1 MTT实验测定鲟鱼多肽对细胞存活率的影响
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)能够被活细胞体内的线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为蓝紫色的结晶沉淀物，不能被死细胞还原，二甲亚砜能够溶解紫色沉淀物，其溶液在490nm处的吸光度值能反应活细胞的数量。
取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度，按1×10^5个/ml每孔100ul细胞接种于96孔板中，于37℃ 5% CO2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100ul DMEM基础培养基（不含血清）；阳性对照组加入100 ul LPS（基础培养基稀释至1ug/ml）；实验组给予不同浓度（12.5-1000ug/ml）的鲟鱼多肽溶液（基础培养基配制），继续培养24 h，弃掉上清，加入100ul的MTT溶液（用DMEM基础培养基配制成终浓度0.5 mg/ml），然后进一步温育4小时。吸出培养基后，向各孔中加入150ul DMSO以溶解甲瓒晶体，在490nm处测定其吸光度值。细胞活力=（OD实验-OD空白）/（ODcontrol-OD空白）。
3.2 鲟鱼多肽对细胞分泌NO的影响
取对数生长期细胞，通过细胞计数后调整细胞浓度为1×10^6个/ml接种于24孔板中，于37℃ 5% CO2中培养24h后，弃掉上清液，空白对照组加入100ul DMEM基础培养基（不含血清）；实验组给予不同浓度（12.5-500ug/ml）的鲟鱼多肽（基础培养基配制），继续培养24 h，收集上清液2500r/min离心10min，分别取100ul于酶标板中，然后加入等量的Griess试剂，室温静置30min后，于540nm处测定吸光度。根据标准曲线计算上清液中的亚硝酸盐（NO2-）含量。
实验结果
4.1 MTT实验测定鲟鱼多肽对细胞存活率的影响
巨噬细胞是单核巨噬细胞系统中的主要成分，具有吞噬外来入侵的病原微生物、处理和呈递抗原多种作用，通过吞噬和分泌细胞因子从而杀死外来病原体，对维持人体健康起到了关键作用。LPS（脂多糖）是一种可以激活巨噬细胞的物质，因此本实验选择其作为阳性对照。MTT实验可以用于评价药物对细胞的毒性影响，细胞活力大小与细胞毒性呈负相关，一般认为细胞活力＜90%即具有一定的细胞毒性，细胞活力＞90%即不具有细胞毒性。图4-1是不同浓度的鲟鱼多肽对Raw264.7细胞的毒性作用，当鲟鱼多肽在12.5-500µg/ml浓度范围内时对该细胞没有毒性作用，并在一定程度上可促进巨噬细胞的增殖，当鲟鱼多肽在12-250µg/ml浓度范围内时，增殖活性随鲟鱼多肽的浓度增加而增加，并且均高于阳性对照组的增殖活性（118.76±5.78％），其最大增殖活性为143.97±8.6%。
图4-1 鲟鱼多肽对 RAW264.7 细胞活力的影响
4.2 鲟鱼多肽对细胞分泌NO的影响
NO也是免疫反应中重要的细胞因子，可由被激活的巨噬细胞分泌，是一种反应性氮中间产物，属于具有氧化性能的自由基。少量的NO便具有极强的杀伤力，能够病原体和肿瘤细胞等。但是NO若分泌过量，也能损坏正常的宿主细胞，从而引起全身性的炎症反应。因此，当机体无炎症时，少量的NO即可提高机体的免疫功能。根据前面MTT实验的结果选择12.5-500µg/ml进行下一步实验。从图4-3是不同浓度的鲟鱼多肽对Raw264.7细胞分泌NO的影响，各个浓度的鲟鱼多肽均能促进Raw264.7细胞分泌NO，在浓度为100µg/ml时其促进作用最大，为12.04±0.17µM。
图4-2 鲟鱼多肽对 RAW264.7 细胞分泌NO的影响
实验小结
